Il Museo è ospitato all'interno della Porta San Sebastiano, una delle più grandi e meglio conservate delle mura Aureliane.
Nel 1939, nonostante il parere contrario della Ripartizione Antichità e Belle Arti, furono eseguiti alcuni lavori negli ambienti interni della Porta per adattarli ad abitazione e studio privato del segretario del partito fascista Ettore Muti.
Dopo la seconda guerra mondiale la Porta venne riaperta al pubblico dal Comune che diede anche inizio alla stesura di un progetto per la realizzazione di un museo delle mura. La Ripartizione Antichità e Belle Arti vi allestì un piccolo Museo delle Mura collegandolo con il tratto di cammino di ronda coperto fino alla via C. Colombo.
L'allestimento museale, suddiviso in tre sezioni tra il primo e il secondo piano della porta, offre ai visitatori un itinerario didattico interamente dedicato alle mura di Roma, dalle mura serviane ai fortini umbertini. Un modo di ripercorrere la storia della capitale da un insolito punto di vista.